亲，想第一时间收到养猪行业最新资讯吗？那就点击上面蓝色字体“中国猪业” 猪细小病毒（PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，PPV感染主要引起胚胎和胎儿死亡、重吸收、流产、木乃伊胎等，但母猪不表现明显的症状。VP2是构成PPV病毒粒子的主要衣壳蛋白，也是中和抗体作用的主要靶蛋白，具有良好的免疫原性，在哺乳动物细胞内或杆状病毒表达系统进行VP2的体外表达，可以在体外自我装配形成VLPs。另外，VP2蛋白可以作为一种抗原的转运载体，携带外源表位，组装成嵌合表位VLPs，嵌合表位VLPs免疫动物具有双重的免疫效果。Martine等（）将PPVVP2基因克隆到杆状病毒系统中，并成功地在昆虫细胞中高效表达，表明VP2多肽能够自我装配成VLPs，该研究为PPV新型亚单位疫苗的研究提供了新思路，而且PPVVLPs不仅自身可以作为疫苗，在外源多肽的转运及多价疫苗的研制中也发挥重要作用。F.G.A.Adriaan等（）用昆虫细胞中表达的PPVVP2基因产物制备VLPs疫苗，在添加免疫佐剂的情况下，VLPs疫苗可在猪体内产生高滴度的血清抗体。
1.2口蹄疫
董艳美等（）选择了口蹄疫病毒（FMDV）O/HLJOC12/03毒株的VP1蛋白上关键的抗原决定簇第～位氨基酸对应的核苷酸序列，利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）插入到MS2噬菌体的外壳蛋白基因的特定位点，经过大肠杆菌诱导表达FMDV的抗原决定簇多肽表达展示在MS2表面的VLPs。结果证实该VLPs蛋白可以很好地诱导被免疫的小鼠产生特异的抗体，且具有很好的免疫原性。该研究为进一步开发出新型的FMD的VLPs疫苗提供了实验依据。董虎等（）将FLAG序列通过融合PCR技术插入FMDV结构蛋白VP1GH-loop可变区，并通过大肠杆菌原核表达技术表达FMDV衣壳蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1，在体外组装出嵌合FLAG外源多肽的VLPs，以期为研究制备多联或多价FMDV的VLPs疫苗奠定基础。潘群兴等（）为增强表位疫苗的免疫原性，为了研制开发免疫原性更好、成本低的新型疫苗，以PPVVP2病毒样颗粒作为外源免疫原性多肽的分子载体，利用杆状病毒表达载体系统表达了O型FMDVVP1中T细胞表位肽嵌合的PPVVP2病毒样颗粒[rPPV：VLP（FMDV）]。潘群兴等（）进一步研究表明，该嵌合FMDVT抗原表位PPVVP2表达蛋白构成的细小病毒样颗粒，在无免疫佐剂存在的情况下免疫小鼠后，在低浓度FMDV抗原下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应，表明嵌合VLPs具有良好的免疫原性，这为在猪体进行该VLPs的免疫研究以及不需要佐剂的颗粒化疫苗的研制提供了实验依据，也为PPV、FMDV二联因工程疫苗的研究奠定了基础。
1.3猪伪狂犬病
国内外诸多学者已应用杆状病毒表达系统成功表达出PPV的VP2蛋白及其自我装配成的VLPs，但应用伪狂犬病病毒（PRV）表达系统表达PPV的VP2蛋白及其自我装配成的VLPs还鲜见报道。陈杨等（）成功实现了利用PRV载体表达PPV的VP2蛋白的VLPs，通过IFA检测了VP2基因在PRV中的表达，并通过电镜观察到了VP2基因表达产物可自我装配成VLPs，且在1个细胞中可以同时观察到PRV与PPV两种VLPs，实现了利用PRV表达系统表达PPV的VP2蛋白的VLPs。若进一步研究表明PRVSA/VP2株可作为疫苗株，则通过培养PRVSA/VP2就可以直接生产出PRV-PPV二联疫苗，不需要灭活或分离PRV，并起到“一免多防”的功效，在生产成本方面也将极具优势。
1.4猪瘟
猪瘟病毒（CSFV）是引起猪瘟的病原，相应于其非结构蛋白NS2-3的～氨基酸残基的多肽E，含有CSFV特异的辅助性T细胞表位和CTL细胞表位，在体液免疫和细胞免疫中均具有重要作用，为CSFV的免疫优势T细胞抗原表位。范京惠等（）将PPV的VP2基因克隆至真核表达载体pMelBacA的XhoⅠ和KpnⅠ之间的多克隆位点，并在VP2基因的5端插入CSFV的T细胞表位基因E，在成功构建了重组子pM-VP2-E阳性质粒的基础上，将其与Bac-N-BlueDNA共转染昆虫细胞sf9，形成的重组杆状病毒在体外表达后，表达蛋白具有天然蛋白的生物学特性，且通过自我组装后形成的VLPs，在无免疫佐剂的情况下免疫小鼠，诱导机体产生了高效价的抗PPV抗体及CSFV特异的CTL反应，而且产生的抗PPV抗体效价显著高于灭活疫苗免疫组。这为在猪体进行此VLPs的免疫研究以及不需要佐剂的颗粒化疫苗的研制提供了基础资料。徐义刚等（）用乳酸菌表达CSFV特异性的CTL表位E和PPV的VP2，口腔免疫猪，结果表明在没有佐剂的条件下，重组的乳酸菌可以诱导强烈的黏膜免疫及CSFV特异性的CD8+型的CTL反应，可以抵抗致死剂量的CSFV的攻击。
1.5猪乙型脑炎
猪乙型脑炎是日本脑炎病毒（JEV）引起的人畜共患传染病。JEVE蛋白结构域III（EDIII）是诱导中和抗体的重要区域，EDIII的一个环肽（loop3）能通过干扰病毒吸附细胞抑制病毒感染。乙肝核心蛋白（HBC）是乙肝病毒的重要结构蛋白，它在细菌、真核细胞以及哺乳动物细胞内均能被高效表达并自动装配成VLPs，是一种良好的表位展示免疫载体。而且在HBC特定位置插入的外源短肽序列不会影响HBC的构象及自我组装，同时插入的外源短肽能以多次重复的方式被展现在VLPs表面，从而能大大提高表位肽的免疫原性。李朋（）首先构建了以HBC为载体的重组融合表达质粒pET28a-HBC-loop3，在HBC的MIR区插入JEVEDIIIloop3表位基因。结果证明了该VLPs抗原具有良好的免疫原性。PPV和JEV均是引起母猪繁殖障碍的主要病原。为了有效预防这2种病原引起的疫病，蒋春英（）把JEVE蛋白上4个B细胞表位及2个T细胞表位基因与PPV结构蛋白基因VP2串联起来，构建成VLPs[PPV：VLP（JEV）]，并在细菌中高效表达。重组蛋白纯化后，体外组装成VLPs后免疫小鼠研究其免疫原性。结果表明展示JEV多B细胞表位和T细胞表位的PPVVLPs能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应，从而为研究安全有效的JEV和PPV二联基因工程疫苗提供了新的思路和方法。在目前应用的一些弱毒疫苗和灭活疫苗存在缺陷和不足的情况下，该嵌合VLPs具有较大的潜在价值。
1.6猪圆环病毒病
猪圆环病毒2型（PCV2）是引起仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）为代表的系列疾病的病原，主要侵害6～12周龄的仔猪。PCV2的感染呈世界性分布，已成为危害养猪业健康发展的重要病因之一。尹双辉（）首次利用E.coli表达的重组蛋白在体外制备Cap蛋白VLPs，为研制PCV2VLPs疫苗奠定了基础。结果证明体外制备的PCV2CapVLPs疫苗有确实的刺激机体体液免疫和细胞免疫反应的能力。李玲等（）应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统，获得PCV2b的重组杆状病毒。将该重组杆状病毒感染HighFiveTM细胞后，VLPs在培养上清中的大量存在，为目的蛋白的分离和纯化提供了便利，也为PCV2基因工程疫苗的产业化奠定了基础。PPV不仅可引发严重的繁殖障碍性疾病，导致胚胎和胎儿死亡；而且能同PCV2混合感染，在PMWS感染中发挥着重要作用。Pan等（）运用PPVVP2VLPs作为表位展示载体，在VP2的N端插入PCV2主要T细胞抗原表位，转染HEK-细胞，在腺病毒表达载体中成功表达出嵌合VLPs［PPV：VLP（PCV2）］；将该带有PCV2抗原表位的PPV颗粒在无免疫佐剂参与的情况下免疫小鼠，嵌合的VLPs不仅能诱导小鼠机体产生PCV2特异性的CTL反应，还能刺激小鼠产生高效价的PPV特异性抗体。朱玲等（）选择PPVVP2蛋白的2个位点插入PCV2ORF2蛋白，构建2个不同的重组体，结果获得期望中的具有良好免疫原性的[PPVVP2：PCV2ORF2]重组VLPs，同时也揭示PPVVPLs的N端1/3适于外源蛋白插入构建重组VLPs。
1.7猪蓝耳病
李杨（）利用杆状病毒表达系统高效表达了PRRSVGP2b、GP5、M和N蛋白，并证实共表达GP5和M蛋白可组装成VLPs，而GP2b有助于VLPs的释放。
1.8猪传染性胃肠炎
猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床症状的高度传染性疾病，尤其对2周龄以内的仔猪具有很高的致死率，死亡率可达%。该病呈世界性分布，给各国养猪业均造成了严重的经济损失。Baudoux等（）研究表明，体外共表达TGEV的M、sM蛋白可形成VLPs，且病毒粒子被释放到细胞培养液中。M蛋白与sM蛋白形成的VLPs能够诱导IFN-α的产生，具有防御TGEV的感染的作用。冷勇等（）、宋振辉等（）研究利用家蚕Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了TGEV的M蛋白、sM蛋白和N蛋白的重组杆状病毒，VLPs的体外组装试验表明在sf9细胞内M蛋白单独表达，M蛋白和sM蛋白共表达，M蛋白和N蛋白共表达，都可形成VLPs，且VLPs大小不等。这为进一步研究TGEV的装配提供理论依据和基础实验材料。
2存在的问题与展望
VLPs疫苗作为一种新型的基因工程疫苗，其具有强大的免疫优势：表面结构规则，大小合适，不含核酸，不能自主复制，不具有传染性，易于被免疫系统识别并产生很好的免疫效果；在血清中的半衰期较长；质量稳定、安全可靠等等。这极大地吸引了众多疫苗研发者的目光。VLPs作为免疫原与病毒颗粒一样，在没有佐剂的情况下，低剂量也能激起高效的免疫反应，这将有利于打破肿瘤和病毒慢性感染所产生的免疫耐受，使VLPs展示表位疫苗具备直接用于治疗的特性。因此，VLPs作为一种新型疫苗，不仅克服了传统疫苗的不足，而且也弥补了基因疫苗的缺憾，是目前最有发展前景的预防兼治疗的候选疫苗，在肿瘤、传染病、过敏性疾病的预防和治疗上展现了广阔的前景，为科学研究开辟了新的探索领域。然而VLPs作为预防性疫苗还有很多问题需要探索。如表达系统的选择、VLPs组装效率的提高以及病毒变异带来的免疫逃避；建立多基因共表达载体的难度大，各个基因表达量的比例难以控制；VLPs作为疫苗多是几种型特异性多价疫苗，而多价苗之间的量效关系确定较为复杂；有的VLPs必需在添加佐剂后才能达到免疫效果，而佐剂和VLPs的剂量比例关系需要进一步验证；VLPs作为疫苗的最佳免疫途径、剂量和保护作用的确切评价还无定论；VLPs疫苗的免疫效果与全病毒疫苗（灭活苗或弱毒苗）接近，但在交叉免疫方面仍然存在缺陷等等。虽然VLPs疫苗存在诸多不足，但是基于VLPs构建多价或嵌合疫苗具有广阔的前景，相信随着以上问题的逐步解决，更多VLPs疫苗的成功问世指日可待。（资料来源：庄金秋等,猪业科学,(5),P98-）
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