作者：杨凡，徐志文，李萍，等
猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。病猪以新生仔猪的急性死亡，4周龄以上的仔猪出现呕吐、神经症状和妊娠母猪流产、产死胎及呼吸道症状为主要特征，可能引起人的轻微感染。伪狂犬病的首次发现追溯到年的美国牛群中，随后蔓延分布至全世界。年，我国首次报道PRV，目前该病已在国内广泛流行。本病尚无有效治疗的药物，只能靠接种疫苗预防，给养猪业带来了巨大的经济损失。年3月，四川崇州某规模化猪场出现疑似伪狂犬病症状病猪，剖检发现患病猪扁桃体、肝和脾均有散在的白色坏死点，肾脏有针尖大小出血点，且出现神经症状的病猪脑脊液增多。本研究拟采集发病猪脑组织，进行基于PRVgE基因的PCR检测，经PCR检测为阳性的病料接种PK-15细胞开展病毒分离，并将分离所得病毒株再次进行PCR检测，用蚀斑实验测定该病毒株的滴度，采用琼扩实验对该病毒进一步鉴定。最后，根据相应诊断结果提出综合防治措施。
1材料和方法1.1实验材料
1.1.1病料采集
无菌采集崇州某猪场疑似PRV发病仔猪脑组织，经研钵研磨后，加PBS配制1﹕5组织悬液，-20℃冻存。
1.1.2实验试剂
单位双抗；猪肾传代细胞（PK-15）由实验室保存；新生犊牛血清、DMEM细胞培养液购自Gibco公司；营养液（含10%犊牛血清）、维持液（含2%犊牛血清）、无钙镁水；饱和酚、氯仿、异丙醇、25%冰乙醇；PRV阳性血清、PCR试剂盒等。
1.2实验方法
1.2.1总DNA提取
取出冻存的组织悬液，-20℃和37℃，反复冻融3次，r/min离心5min；取μL上清液于无菌EP管中，加入μL饱和酚，混匀，静置5min，4℃，r/min离心5min；取上清，加入酚、氯仿各μL，混匀，静置5min，4℃，r/min离心5min；取上清，加入酚、氯仿各μL，混匀，静置5min，4℃，r/min离心5min；取上清，加入μL氯仿，混匀，静置5min，4℃，r/min离心5min；取上清，加入2倍体积异丙醇，轻摇约2min，室温静置15min，4℃，r/min离心15min；弃上清液，加入1mL25%冰乙醇洗涤沉淀及管壁，4℃，r/min离心5min；弃上清液，室温干燥沉淀后加入35μLddH2O溶解，-20℃保存备用。同时，提取正常细胞的DNA做阴性对照。
1.2.2病料PCR检测
根据GenBank上发表的PRVgE基因保守序列设计合成1对引物，上游引物：5’-TGCTCGTGATGACCCACAAA-3’；下游引物：5’-TGTACACCGGCGAGAGCAT-3’，预期目的片段大小为bp。引物序列送至宝生物工程（大连）有限公司合成。
以提取的病毒DNA和正常细胞DNA为模板，按照下列PCR体系（10μL体系）进行扩增（见表1）。
反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火35s，72℃延伸35s，总共35个循环；72℃总延伸7min；4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察记录实验结果。
1.2.3病毒分离
取出冻存的组织悬液，反复冻融3次，离心取上清，每1mL上清液加单位双抗，置4℃处理过夜。
观察培养的PK-15细胞生长状况，当贴壁铺满单层，弃去培养液，无钙镁水洗2～3次，每瓶接种μL处理好的组织悬液，对照组加入等量培养液。37℃吸附作用1h，在此期间每隔15min轻轻摇晃细胞瓶，使细胞和病毒液充分接触。每瓶加入4mL维持液，37℃恒温培养箱培养。当细胞病变达70%以上时收毒，即-20℃和37℃反复冻融3次，r/min离心15min，取上清。将收取的病毒液继续接种PK-15单层细胞传代培养，先盲传3代，直至产生稳定的细胞病变，收毒，-70℃冻存。
1.2.4病毒PCR检测
按1.2.1步骤，用酚、氯仿法抽提第5代、第7代病毒液总DNA，进行猪伪狂犬病病毒的PCR检测。同时，应用本实验室建立的猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）RT-PCR检测方法和猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）PCR检测方法，对第7代病毒液进行外源性病毒检测。
1.2.5蚀斑实验
将六孔培养板中各孔已长满单层细胞的的营养液吸弃，并将第7代病毒液连续进行10倍稀释，选取10-2稀释度，接种于六孔板各孔，每孔0.2mL，轻轻摇动使病毒液均匀分布于细胞表面；置37℃的恒温培养箱培养，吸附1h后，加入1%甲基纤维素培养基，使其均匀覆盖于细胞表面；置37℃恒温培养箱中，培养2～7d；将覆盖的甲基纤维素吸出弃之，用5%福尔马林-1%结晶紫固定染色液固定和染色感染细胞，每孔加入1mL；20min后，用水冲洗，观察细胞生长状况，记录蚀斑个数。
1.2.6琼扩实验
用PBS配制1%琼脂液，倒于平板内制成凝胶。取打孔器在琼脂凝胶上打梅花孔，孔径为2mm，中央孔与周围孔间距约3mm。将病毒液作2倍倍比稀释，即1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶、1∶。中央孔滴加PRV阳性血清，周围孔分别滴加稀释后的病毒液。试验设立对照组，中央孔滴加PRV阳性血清，周围各孔均滴加等量的稀释液。保持一定湿度，37℃恒温培养箱扩散24h，观察记录沉淀线情况。
2实验结果2.1病料PCR检测
用组织悬液抽提得到的DNA为模板，进行PCR引物扩增，设立PRV阴性和阳性对照，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，以DNAMarkerDL0为标准，病料模板PCR扩增产物大小近似bp，扩增出的特异性片段与预期的大小一致（图1）。
2.2病毒分离
经处理的PCR检测为阳性的送检病猪病料，接种PK-15细胞，盲传3代未见明显细胞病变。传至第4代，接毒后46h可见部分细胞变圆、变亮、脱落形成典型的空斑，对照组无细胞变圆、脱落；病毒传至第5代以后，感染后38h均可见80%左右细胞产生病变，主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且细胞病变初可见典型的空斑，即在PK-15细胞上产生稳定细胞病变，对照组细胞贴壁良好，无明显细胞病变（图2）。
2.3病毒PCR检测
用第5、第7代病毒液抽提得到的DNA为模板，进行PCR引物扩增，设立PRV阴性和阳性对照，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，以DNAMarkerDL0为标准，病毒液模板PCR扩增产物大小近似bp，扩增出的特异性片段与预期的大小一致，而外源性病毒：CSFV、PRRSV、JEV、PPV、PCV2检测均为阴性（图3）。
2.4蚀斑实验
将收获的第7代病毒液稀释后，选择10-2稀释度接种PK-15细胞，接种后于37℃培养箱避光培养5d，观察并记录蚀斑个数，测得六孔板中平均每孔形成53个蚀斑，则病毒悬液的蚀斑形成单位为2.65×PFU/mL，即每1mL病毒液滴度为2.65×PFU（图4）。
2.5琼扩实验
将病毒液作2倍倍比稀释，实验组中央孔滴加PRV阳性血清，周围孔分别滴加稀释后的病毒液。对照组中央孔滴加PRV阳性血清，周围孔滴加等量的病毒稀释液。结果发现：病毒原液至32倍稀释均可见抗原抗体沉淀带，从64倍稀释度开始未见沉淀带。对照组中均未见抗原抗体沉淀带（见图5）。
3结果讨论目前，我们已掌握许多对猪伪狂犬病病毒进行分离鉴定的方法，比如聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）、蚀斑实验（plaqueformationtest）、琼脂凝胶免疫扩散实验（agargelimmunodiffusiontest，AGID）等。PCR技术又称为体外基因扩增技术，诞生于年。Belak等应用gB基因引物率先建立了检测PRV的PCR方法，检测PRV与其他猪病毒病的多重PCR方法在近年也相继建立。PCR具有敏感、快速、特异性强等优点，还能活体检测大批量样品，目前在病毒鉴定上已经得到广泛运用；AGID最早的应用是在年为研究利泽甘氏现象，年应用于细菌菌株的鉴定。Oudin于年在试管中进行了琼扩实验，对抗原混合物进行分析。Elek和Ouchterlony于年分别建立了琼脂双向双扩散法，可以同时鉴定、比较2种以上抗原或抗体，并对免疫扩散的理论依据相继进行了研究。琼扩试验操作简单、快捷，较适用于现场定性诊断和猪群阴性无感染者的普查，但结果易受pH、温度等影响。
PRV广泛分布于机体各组织脏器中，比如扁桃体、肝脏、脾脏、肺和肾脏，但感染量以脑部三叉神经节居多，因此实验中主要采集病猪脑组织进行病毒的分离培养。PRV具有泛嗜性，能在许多细胞中增殖，其中以ST细胞和PK-15细胞最敏感，在接种后24～72h可出现典型的细胞病变，其次是BHK-21、MDBK、CEF等细胞。试验中常用PK-15、BHK-21、MDBK等传代细胞系分离培养该病毒。
本实验从病猪脑组织分离得到1株PRV，对该株病毒进行PCR检测、蚀斑实验、琼扩实验后，证实该分离是成功的。针对以上实验结果，对猪场建议主要包括以下几个方面。第一，立即淘汰出现相应临床特征的猪群，尤其是仔猪和种猪，同时采用2%～3%氢氧化钠或熟石灰对相应圈舍地面、墙壁及周围场地进行严格消毒处理。第二，抽取猪场中所有猪只血样，并标记清楚。用PRVgE抗体检测试剂盒进行抗体检测，淘汰检测结果呈阳性的全部猪只，阴性猪只进行严格隔离饲养。对测定结果为可疑的猪只先实行隔离饲养，然后重新采血检测，根据检测结果作出相应处理。第三，采集隔离饲养的所有健康猪群血样，进行PRVgB抗体检测，对所有阴性猪只紧急接种弱毒疫苗。第四，完善饲养管理制度。严禁从PRV阳性猪场引种，对待引进猪只采血检测，确定为阴性后方可引进，最好自繁自养。猪群尽量做到全进全出。猪场实行封闭式管理，外来人员必须经过相应消毒措施处理，隔离3d后才可进入生产区。圈舍和周围场地平时严格消毒，做好清洁卫生。针对不同生长阶段的猪群，合理搭配日粮。第五，制定合理免疫程序。仔猪出生3日龄后进行伪狂犬病疫苗滴鼻免疫，5～6周龄时肌肉注射1头份，种公猪每半年普免1次，母猪产前3个月普免1次。
本文选自《猪业科学》年第10期“猪场兽医”栏目中P68-70
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